Konstruksi Plasmid Rekombinan pET-28a-Nanobodi Secara In Silico

Abstract

Nanobodi merupakan fragmen antibodi yang mampu mengikat antigen tertentu secara selektif, memilik ukuran kecil, dapat berpenetrasi ke dalam jaringan, mudah dimodifikasi dan diproduksi untuk tujuan diagnostik atau terapeutik. Kelebihan tersebut membuat nanobodi potensial untuk digunakan sebagai komponen dalam kit diagnostik, salah satunya yaitu untuk mendeteksi kortisol. Tujuan penelitian ini untuk membuat konstruk plasmid rekombinan pET-28a-Nanobodi secara in silico. Metode penelitian ini adalah urutan asam amino nanobodi yang mengikat kortisol diambil dari Protein Data Bank (PDB) dengan kode 6ITP yang kemudian ditranslasi balik menjadi DNA. Pengecekan kodon yang sesuai dengan Escherichia coli dilakukan menggunakan Graphical Codon Usage Analyzer (GCUA) dan dianalisis peta restriksinya menggunakan NEBCutter. Perancangan primer dibuat secara manual dengan menambahkan sisi restriksi yang sesuai plasmid pET-28a, kodon start, dan kodon stop. Analisis primer dilakukan melalui oligoanalyzer. Gen nanobodi kemudian diligasikan dengan pET-28a dan dilakukan pengecekan kesesuaian kerangka baca. Hasil dari penelitian ini adalah gen nanobodi terdiri dari 381 basa nitrogen yang dapat diperbanyak secara in vitro melalui PCR. Primer yang dapat digunakan adalah primer forward dengan penambahan sisi restriksi EcoRI 5‘-GAATTCATGCAGGTTCAGCTGCAGGAA-3‘ dan primer reverse dengan penambahan sisi restriksi XhoI 5‘- CTCGAGTTAGCTGCTAACGGTAACCTG - 3‘. Gen nanobodi dapat menyisip kedalam plasmid pET-28a tanpa mengubah pembacaan. Konstruksi pET-28a-Nanobodi menghasilkan kerangka pembacaan sesuai dengan asam amino yang diharapkan.